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                    細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)

                    更新時間:2022-04-27  |  點(diǎn)擊率:609

                    細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時,質(zhì)膜不完整,PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,它可嵌入到DNA或RNA中,使壞死細(xì)胞著色,凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì),可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞,因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱,它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合(主要結(jié)合于A-T)堿基區(qū)),顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。


                    一、試劑準(zhǔn)備

                    1. 三尖杉酯堿(HT):300μg/ml;
                    2. Tris-HCl(pH7.5):100mmol/L;
                    3. EDTA緩沖液:5mol/L;


                    4. 堿性裂解液:0.2mol/L NaOH;
                    5. 醋酸鈉:3mol/L KAc(pH4.8);
                    6. PI母液:500μg/ml;
                    7. Ho33342母液:2mmol/L;
                    8. 人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞:用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。
                    9. 其他:異丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚藍(lán)、蔗糖指示劑、TBE電泳緩沖液、1%瓊脂糖、溴乙錠。

                    二、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細(xì)胞凋亡

                    1. 實(shí)驗(yàn)前約24小時,接種兩瓶HL-60細(xì)胞,標(biāo)記①、②,每瓶含約6 ml培養(yǎng)液,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

                    2. 實(shí)驗(yàn)前約2.5小時,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%,①號瓶加入三尖杉酯堿200 μl,使終濃度為1 μg/ml,②號瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時。

                    3. Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細(xì)胞

                    (1)染色:將瓶中的細(xì)胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中,加入Ho33342母液2 μl,PI 20 μl,染色15分鐘。

                    (2)滴片:取一載玻片用雙面膠圍成一小室,從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10 μl,加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片,熒光鏡下用紫外激發(fā)光,高倍鏡下觀察,區(qū)別三種細(xì)胞,并注意三者比例。


                    注意事項(xiàng)

                    1. 誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時間要準(zhǔn)確;

                    2. 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時,由于熒光易碎滅,觀察時要盡量快。


                    Ausbian®特級胎牛血清所有血清出廠前,均經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控,每個批次附有詳細(xì)完整的《檢測報(bào)告》,包括:品名,貨號,批號,血源地,生產(chǎn)日期,保質(zhì)期,pH值、滲透壓、血紅蛋白、總蛋白、球蛋白、IgG、內(nèi)毒素、無菌檢查(細(xì)菌、真菌、支原體)、病毒檢查(如BVD、牛腺病毒、細(xì)胞病變效應(yīng)等)、促細(xì)胞生長能力、細(xì)胞毒性、BVD-1/2抗體檢查等。

                    實(shí)驗(yàn)人對于新批次血清,應(yīng)認(rèn)真審閱《檢測報(bào)告》,做好試用前篩選第一步。(如何看懂《檢測報(bào)告》,可登陸“締一生物"網(wǎng)站,留言技術(shù)部,得到免費(fèi)幫助。)


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